qPCR数据处理，一键出图

DungDaj · 发表于 2021-12-7 14:08

今天，我们来介绍一下qPCR的数据处理。

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在同学（zi）的（ji）强（xian）烈（de）要（mei）求（shi）下，我的qPCR数据处理小程序，不仅拥有了自动添加误差线的功能，还能自动进行T-test 假设检验，一键出图，大家感受一下，一键出图的魅力。

<hr/>qPCR是什么操作

qPCR这项技术，被广泛用于生物学的研究，只有有以下用途：

DNA 定量
RNA 定量
Genotyping (设计特性型基因探针，通过荧光判断基因型)

qPCR作为一种DNA定量手段，一般情况下，还可以分为绝对定量和相对定量。

绝对定量 是通过利用已知浓度的DNA样本绘制标准曲线，然后得到未知样的DNA含量
相对定量 是通过与管家基因的比较得到相对的基因表达值

好的，那么一般情况下，我见过比较多的qPCR，都是以RNA相对定量为目的的，也是本文讨论的焦点。
<hr/>qPCR怎么个q法

qPCR和PCR一看名字就知道很像，q就是quantitative的意思，quantitative就是定量的意思。。。（为我的废话鼓掌）

那么，怎么通过qPCR定量呢？

其实，说到底，qPCR就是通过荧光染料或者荧光探针来表征PCR产物的量，进而推断出PCR前，样本的初始核酸量。
具体原理是，对于不同的样本和基因，比较到达一定荧光强度所需要的循环数，如果你的样本中DNA1的量大于DNA2的量，那么理论上， DNA1比DNA2需要更少次数的PCR扩增就可以达到某一个阈值.

想情况下,比如你的样本中DNA1有32条，DNA2有8条，那么我们如果设置阈值在1024条，那么DNA1需要5次循环， DNA2需要7次才能到达，也就是说相差两次循环，一次循环是翻一番，两次就是4倍，这样我们就知道了 DNA1的量为DNA2的两倍这就是相对定量

如果对于详细原理有什么执念的同学可以自行百度，必应，谷歌。。。
<hr/>如何计算

在实际实验过程中，我们的实验没那么简单
一个例子：

我用某一药物处理了细胞，我想知道该处理对细胞内geneA的转录水平的影响。

那么我们一般这样做，有处理和未处理的细胞，我们想比较这两种细胞内geneA表达量的差异。我们在提取细胞的RNA并定量后反转成cDNA后，进行qPCR，获得geneA和某一个内参基因（如GAPDH）的CT值。
内参基因GAPDH在这里起到一个矫正的效果来去除不同的样品间RNA产量，RNA质量以及逆转录效率上的差别。
最最最常用的qPCR相对定量的方法是 ΔΔCT 法（读作：delta delta CT）
公式如下

ΔCT = CT(target gene) CT(reference gene).
ΔΔCT = ΔCT(target sample) ΔCT(reference sample)

即先用内参基因校准，再算样品与对照组间的差异，而我们的表达量的差异就可以表征为

虽然大多数qPCR设备（Roche， ABI云云）都配有很完备的分析软件，但是。。。
这些软件的图可能不适合直接放文章，或者，咳咳，很丑,你想自己修改之类的
而他们一般都不太提供最终计算结果，只提供CT值，那么这个就很让人头大了。

于是乎，秉承着 自己动手丰衣足食 一直折腾一直爽的传统美德，我写了一个小小的工具，方便大家计算最终的相对表达量
该工具基于微软爸爸的EXCEL和VBA，不限样本数量，基因数量及每组实验的平行个数（如果你有三个复孔，其中一个如果CT和其他两个差别很大，你可以删除该孔，有些组3个复孔，有些2个，不影响程序运行），现在，该程序不仅拥有了自动添加误差线的功能，还能自动进行T-test 假设检验，一键出图，欢迎大家体验！
成热打铁，这里介绍一下用法
软件数据格式

数据分析，就和做菜一样，巧妇难为无米之炊，不仅如此，这米烂了也不行。所有的数据分析，无论是计算还是作图，数据格式都是关键。合适的数据格式才能清楚、高效、准确的表达数据。
我相信，大家很多时候做qPCR的时候，表格格式是这样的：

但是，这样会面临非常大的问题，就是实验平行怎么放？
如果你一定要放，平行自然可以放进去，比如三个平行可以并排横着或者竖着放进 ...的位置。

但是，这样格式的数据，限制很大，比如

你可以很方便的求出平均值吗?

如果你使用公式计算，怎么兼容不同平行个数的情况?

如果你的样本有好几个水平的处理，又要怎么表示？

结果，许多同学的表格就成了这样：
为了表示某实验用了4种质粒，分别做了三种处理，每种处理要测三个基因，每个基因三个平行（图中的一个单元格...，实际是三个单元格，一组平行，我偷个懒）

不夸张的说，我见过太多这样的表了。除了看起来好理解一些，数据处理时灵活性和表达能力上欠缺很多。

那要怎么才能清楚、高效，准确的表达数据呢？

其实很简单，我称之为标签化。

什么叫标签化，其实很简单，就是通过对每一个数值附加标签的方式来标注信息。这样数据就是一条一条的了，一条就是一个值和这个值的几个标签
比如，我有一次实验，有2个样本，3个基因，4个平行，也就是我最后的Ct值有2x3x4 = 24个值，我们给这24个值贴标签，每个值有两个标签，分别是对应的样本和所检测的基因。如图：

注意，qPCR技术相对定量计算中，因为我们不区分平行，所以这里不标。
我再举个例子：（就那用上面的例子，四种质粒，三种处理，三个平行）

我们使用一列记录Ct值，一列记录基因，一列记录处理条件，还有一列记录质粒等。

大家可以看到，这种方法下数据由宽变长，所以这种数据格式也叫长数据格式，利用这个原理，可以对每个孔添加非常多列的信息。

那么，我说了那么多，他有哪些好处呢？

这样的数据格式支持无限维度或者非常复杂的的数据，而不像之前只能表示样本和基因两个维度
这样的数据，利用Excel的pivot table可以几秒计算每个分组的均值，方差等
这样的数据在主流数据编程语言中做统计和作图都无比方便，有时这种格式是必须的（ggplot2）
最最重要，绝大多数的qPCR机器，ABI或者Roche，导出的数据都是这种格式，这就意味着，在使用我的程序时，你导出数据后Ctrl C + V就完事了。

软件统计计算

来到了愉快的一键出图的环节了，不过在开始计算之前，还需要再做一件事，那就是指定内参基因和对照组。本次更新就非常人性化地自动统计了数据表中的基因和样本，无需手动输入，只需要在下拉选择框中点选就可以啦，从此避免了输错的可能。
然后，轻轻按下计算键！

本程序对基因和样本不做任何限制，你可以任意名字，任意数量，任意平行，甚至某些分组三个平行，某些两个平行（有时点样失误，删除单个孔）都不受影响，这就是标签化的数据格式带来的便利！

另外，该程序不仅可以计算相对表达量（2^-ddCt法），还自动出图，自动添加误差线，自动进行T-test计算p值。除此之外，获得相对表达量值之后呢，你也可以使用origin或者graphpad等工具作图，读者可以查看我往期关于origin的文章哦！！文章直通车>>> origin科研作图
有了它，真正让少儿科研成为可能，小学生也可以做qPCR数据分析啦！
心动了吗？

fwalker · 发表于 2021-12-7 14:13

这个程序哪里可以获得呢？

redhat9i · 发表于 2021-12-7 14:21

同求小程序

pc8888888 · 发表于 2021-12-7 14:25

该文章转自wechat-official-account 小魔方 sCube，工具在那里可以找到

HuldaGnodim · 发表于 2021-12-7 14:35

这是一个公众号吗

RecursiveFrog · 发表于 2021-12-7 14:40

DungDaj · 发表于 2021-12-7 14:47

为啥我用这个程序算到的对照组的表达均值不是1而是1.088这样的数呢？

闲鱼技术01 · 发表于 2021-12-7 14:51

作者，你的表是四个复孔，我是3个复孔，把你的表修改了之后有些公式错误了[大哭]

RhinoFreak · 发表于 2021-12-7 14:54

你好我这个工具对复孔没要求，几个复孔都可以，填完按一下重新计算

Ilingis · 发表于 2021-12-7 15:01

因为你的对照的平均值为一，对照的单个孔不是1哦

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